林馨倩;郭紫晶;张瑞;向晗一;林含睿;黄雄挺;陈劲松;张志东;李彦敏;【背景】Ras-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1 (Ras-GTPase-activating protein SH3domain binding protein 1, G3BP1)是应激颗粒(stress granule, SG)的重要组成部分和标志性蛋白,在宿主抵抗病原体入侵过程中发挥重要作用。【目的】构建G3BP1稳定敲低的PK-15细胞系,探究敲低G3BP1基因对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)、塞内卡病毒(seneca virus, SVV)和痘苗病毒(vacciniavirus,VACV)复制的影响和对肿瘤坏死因子-α(tumournecrosisfactorα,TNF-α)、白细胞介素6 (interleukin 6, IL-6)、抗黏病毒蛋白1 (myxovirus resistance protein 1, Mx1)、干扰素刺激基因54 (IFN-stimulated gene 54, ISG54)和干扰素β (interferon β, IFN-β)表达的影响,并对该基因进行生物信息学分析。【方法】利用慢病毒载体构建稳定敲低G3BP1基因的PK-15细胞系,利用逆转录实时定量PCR (reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)和实时定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)分析敲低G3BP1基因对VSV、SVV和VACV复制的影响,利用RT-qPCR分析感染VSV、SVV和VACV后敲低G3BP1基因对TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的影响,通过在线工具对G3BP1基因进行生物信息学分析。【结果】RT-qPCR和免疫印迹(Westernblotting,WB)结果显示成功构建稳定敲低G3BP1的PK-15细胞系;RT-qPCR和qPCR结果显示敲低G3BP1基因可极显著促进VSV和SVV的复制(P<0.000 1),但对VACV的复制无显著影响(P>0.05);RT-qPCR结果显示VSV和SVV感染可显著或极显著促进TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的mRNA表达水平(P<0.05,P<0.000 1),敲低G3BP1基因可极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(P<0.01,P<0.000 1),RT-qPCR结果显示VACV感染可以极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(P<0.01,P<0.0001),敲低G3BP1基因对VACV抑制的细胞因子mRNA表达无显著影响(P>0.05);理化性质预测结果显示,猪源G3BP1蛋白存在30个磷酸化位点,具有不稳定性和亲水性,属于非跨膜和非分泌蛋白;蛋白质高级结构预测显示,该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(52.47%)组成,主要定位于细胞质和细胞核中,分别占34.38%和31.25%。【结论】本研究获得了猪源G3BP1基因稳定敲低的PK-15细胞系,敲低该基因可极显著促进VSV和SVV的复制,但对VACV的复制无显著影响;敲低该基因可显著或极显著抑制TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的产生;预测该蛋白存在30个磷酸化位点,为非跨膜和非分泌蛋白,具有不稳定性和亲水性。这些结果可为进一步研究G3BP1在病毒感染过程中的作用机制提供工具和参考依据。
2024年03期 v.51 970-984页 [查看摘要][在线阅读][下载 1773K]